1.1 菌株與培養基

1.1.1 菌株 黑曲霉 FS10（Aspergillus niger FS10） 由作者所在實驗室從大豆醬醅中分離篩選并保藏于中國典型培養物保藏中心， 編號為 CCTCC NO M2013703。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基 （PDB 培養基）：馬鈴薯 300 g，葡萄糖 20 g，氯霉素 0.1 g，蒸餾水 1 L；121 ℃高壓滅菌 20 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 （PDA 培養基）：PDB 培養基， 瓊脂 20 g；121 ℃高壓滅菌 20 min。

1.2 試劑與儀器

AFB1 標準品（質量分數≥99%）：新加坡普瑞邦生物工程有限公司產品；甲醇、乙腈（色譜純）：美國TEDIA 公司產品；三氯甲烷（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司產品；體積分數 2.5%戊二醛溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）：上海碧云天生物公司產品；總 RNA 提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF-MS：美國沃特世公司產品；VB-40 立式高溫高壓滅菌鍋：德國SYSTEC 公司產品；BSC-1300 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司產品；SHP-150 生化培養箱：上海森信實驗儀器有限公司產品；THZ-D 臺式恒溫振蕩器：上海百典儀器設備有限公司產品；EX-OHOUS 電子天平、旋渦振蕩儀：美國奧豪斯公司產品；Scientz-10N 臺式冷凍干燥機、Scientz-10LS 真空離心濃縮儀、SB-5200DT 超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司產品；Eppendorf 離心機：德國艾本德公司產品 ；Milli -Q 超純水儀 ：美國Millipore 公司產品；日立 SU8020 掃描電鏡：日本日立公司產品。

1.3 菌株活化及菌絲體、發酵液、孢子懸液制備

從-80 ℃取出黑曲霉 FS10 進行復蘇， 接種于PDA 培養基中 28 ℃培養 5 d 后， 用含 0.05%（體積分數）吐溫 80 的無菌生理鹽水將孢子洗下，調整孢子濃度為 106 CFU/mL， 作為黑曲霉 FS10 孢子懸液備用。

接種 2%（體積分數） 的黑曲霉 FS10 孢子懸液于 PDB 培養基中， 置于恒溫培養箱中在 28 ℃、 150 r/min 的條件下分別培養 12、24、36、48、60、72 h后，在無菌低溫條件下用快速真空抽濾，將菌絲體和濾液分別收集。所收集的菌絲體用 PBS 洗滌 3次，再高溫滅活后放入無菌 EP 管中備用；所收集的濾液過 0.22 μm 的無菌濾膜除去雜菌后，作為黑曲霉 FS10 發酵液備用。

1.4 AFB1 的提取與檢測

取 1 mL 待測樣品溶液于分液漏斗中， 加入等體積氯仿并上下振蕩 5 min 后靜置分層， 收集下層氯仿層溶液，重復上述提取操作 3 次后將收集的液體合并， 再將合并的液體通過 AFB1 免疫親和柱凈化 ，用真空冷凍干燥機將收集的洗脫液揮干 ，用1 mL 甲醇水（V（甲醇） ∶V（水）=1∶1）溶液復溶，充分振蕩混勻后，通過 0.22 μm 有機濾膜過濾，保存于棕色進樣瓶中待檢測。

采用 WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF-MS 對 AFB1 進 行 檢 測 ， 色 譜 條 件 為 ：BEH C18 色 譜 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流動相：A 為乙腈，B為甲酸銨溶液；進樣量：5 μL；流量：0.3 mL/min；柱溫：45 ℃；梯度洗脫如表 1 所示。

1.5 黑曲霉 FS10 不同組分對 AFB1 降解效果的研究

將 106 CFU/mL 的黑曲霉 FS10 孢子懸液按 2%（體積分數）接種量接種至含有 AFB1 的 PDB 培養基中（AFB1 終質量濃度為 1 μg/mL），同時以含有相同AFB1 質量濃度的無菌 PDB 溶液作為空白對照組，均置于恒溫培養箱中在 28 ℃、150 r/min 的條件下培養，分別培養 12、24、36、48、60、72 h 后取樣，提取AFB1 后測定 AFB1 殘留量，計算 AFB1 殘余率，方法如下：

I=I1/I0×100%

式中：I 為 AFB1 殘余率，%；I0 為降解前 AFB1 質量濃度，μg/mL；I1 為降解后 AFB1 質量濃度，μg/mL。

將 106 CFU/mL 的黑曲霉 FS10 孢子懸液分別吸取 0、1、3、5、7、9 mL， 再分別加入相應質量濃度AFB1 和相應體積無菌生理鹽水使 AFB1 終質量濃度為 1 μg/mL、終體積均為 10 mL?；靹蚝笾糜诤銣嘏囵B箱中在 28 ℃、150 r/min 的條件下培養 24 h 后取樣，提取 AFB1 后測定 AFB1 殘留量，計算 AFB1 殘余率。

將不同培養時間滅活后的黑曲霉 FS10 菌絲體重懸于含有 AFB1 的 PDB 培養基中（AFB1 終質量濃度為 1 μg/mL）， 同時以含有相同 AFB1 質量濃度的無菌 PDB 溶液作為空白對照組，均置于恒溫培養箱中在 28 ℃、150 r/min 的條件下培養 24 h 后取樣，提取 AFB1 后測定 AFB1 殘留量，計算 AFB1 殘余率。

將不同培養時間的黑曲霉 FS10 發酵液吸取990 μL 置于 EP 管中，并加入 10 μL 終質量濃度為100 μg/mL AFB1 標準儲備液 ， 同時以含有相同AFB1 質量濃度的無菌 PDB 溶液作為空白對照組，均置于恒溫培養箱中在 28 ℃、150 r/min 的條件下培養 24 h 后取樣，提取 AFB1 后測定 AFB1 殘留量，計算 AFB1 殘余率。

1.6 AFB1 誘導黑曲霉 FS10 降解能力的研究

將 106 CFU/mL 的黑曲霉 FS10 孢子懸液按 2%（體積分數）接種量接種至含有 AFB1 的 PDB 培養基中（AFB1 終質量濃度為 1 μg/mL），作為誘導組。同時以不含 AFB1 的 PDB 培養基作為未誘導對照組，均置于恒溫培養箱中在 28 ℃、150 r/min 的條件下培養 24 h 后取樣，在無菌低溫條件下進行快速真空抽濾， 分離誘導組和未誘導組上層菌體和下層發酵液 ， 將上層菌體用 PBS 洗滌 3 次后重懸于含有1 μg/mL AFB1 的 PBS 溶液中；將下層發酵液990 μL置于 EP 管中，并加入 10 μL 終質量濃度為 100 μg/mL AFB1 標準儲備液， 同時以含有相同 AFB1 質量濃度的無菌 PDB 溶液作為空白對照組。全部樣品置于恒溫培養箱中在 28 ℃、150 r/min 的條件下分別培養12、24、36 h，提取 AFB1 后測定 AFB1 殘留量，計算AFB1 殘余率。

1.7 黑曲霉 FS10 掃描電鏡樣品的制備

將 106 CFU/mL 的黑曲霉 FS10 孢子懸液按 2%（體積分數）接種量接種至含有 AFB1 的 PDB 培養基中 （AFB1 終質量濃度為 1 μg/mL） 和不含 AFB1 的PDB 培養基中，分別為處理組和對照組，均置于恒溫培養箱中在 28 ℃、150 r/min 的條件下分別培養24、36、48 h 后取樣，在低溫無菌條件下快速真空抽濾去除發酵液，用預冷過的 PBS 溶液洗滌菌體 3 次后取適量菌體轉移至 EP 管中，加入 1 mL 4 ℃預冷的 2.5%（體積分數） 戊二醛溶液， 在 4 ℃下固定過夜，吸出固定劑，用 0.2 mol/L PBS 溶液浸洗 2 次， 10 min/次，再用 4 ℃預冷的 1%（體積分數） OsO4 溶液在 4 ℃條件下固定 1 h， 用 0.2 mol/L PBS 溶液浸洗 2 次，10 min/次。然后用梯度乙醇溶液（體積分數分別為 30%、50%、70% 、80% 、90% 、95% 、100%）脫水，每個梯度乙醇溶液脫水 2 次，15 min/次。采用真空噴鍍法， 將樣品安置于離蒸發源 10~15 cm 處的真空噴鍍儀的樣品臺進行噴金（10 kV、220 s），噴鍍均勻后通過掃描電鏡觀察并拍攝。

1.8 黑曲霉 FS10 轉錄組學分析

將 106 CFU/mL 的黑曲霉 FS10 孢子懸液按 2%（體積分數）接種量接種至含有 AFB1 的 PDB 培養基中 （AFB1 終質量濃度為 1 μg/mL） 和不含 AFB1 的PDB 培養基中，分別為處理組和對照組，均置于恒溫培養箱中在 28 ℃、150 r/min 的條件下培養 36 h后取樣。在低溫無菌條件下快速真空抽濾去除發酵液，用預冷過的 PBS 溶液洗滌菌體 3 次后取適量菌體轉移至 EP 管中。將菌絲體破碎后，使用試劑盒提取 RNA。將質量合格的 RNA 保存在異丙醇中，委托南京派森諾基因科技有限公司進行樣品的轉錄組測序，測序平臺為基于二代測序的 Illumina 平臺。

2.結果與分析

1 黑曲霉 FS10 菌懸液對 AFB1 脫除作用

黑曲霉 FS10 在 PDB 培養基生長期間可顯著降解AFB1（見圖 2）。在 12 h 后 AFB1 質量濃度開始降低， 其中在 12~36 h 的降解速率最快，AFB1 殘余率從 85.08％降至 29.78％。在 72 h 時AFB1 殘余率僅為1.35%。結果表明，黑曲霉 FS10 菌株在生長過程中可以有效脫除 AFB1。

不同字母表示差異性顯著（P＜0.05）。

圖 2 黑曲霉 FS10 菌懸液對 AFB1 脫除作用

2.2 黑曲霉 FS10 孢子對 AFB1 脫除作用

由圖 3 可以看出黑曲霉 FS10 孢子懸液對 AFB1的脫除效果與對照組相比無明顯差異，AFB1 質量濃度基本不隨孢子濃度的增加而變化， 表明黑曲霉FS10 孢子對 AFB1 無任何脫除作用， 故而推測正常生長狀態下的菌體及其發酵液可能具有脫除能力。

2.3 黑曲霉 FS10 菌絲體對 AFB1 的吸附作用

隨著培養時間的延長， 菌絲體的生長量越多，對 AFB1 的脫除效果越好。經高溫滅活處理的菌絲體對 AFB1 有一定的脫除作用， 這種作用可能是菌絲體具有一定的吸附能力引起的（見圖 4）。已有研究表明微生物可通過與 AFB1 結合， 形成菌體和 AFB1 復合物，該復合物整體趨于穩定，且不易被動物機體吸收，從而易排出體外，降低了 AFB1 對動物的危害[25]。錢潘攀等[26]研究表明麝香草酚可誘導酵母細胞發生裂解，導致細胞壁上肽聚糖的結構發生變化并增強其對 AFB1 的吸附能力。但黑曲霉 FS10吸附能力有限，與菌懸液脫除效果相比還存在較大差異，因此需對黑曲霉 FS10 發酵液組分進行研究。

2.4 黑曲霉 FS10 發酵液對 AFB1 脫除作用

不同培養時間的發酵液在一定時間內對 AFB1脫除作用有明顯差異（見圖 5）?？梢酝茰y出黑曲霉FS10 培養時間越長， 其發酵液對 AFB1 脫除效果越好，說明隨著時間的延長，黑曲霉 FS10 發酵液中脫除 AFB1 的物質隨之增加。在 36 h 后，具有降解能力物質大量產出，AFB1 的殘余率顯著下降?，F有研究報道部分微生物對真菌毒素的降解作用是由于其分泌了有特異性的胞外酶。Wang 等[27]采用白腐真菌的過氧化物錳酶 （MnP） 降解 AFB1， 培養 48 h 后 AFB1 的最大消除率達到 86.0%。為了研究 AFB1 處理是否對黑曲霉 FS10 脫除能力有積極的影響，作者進一步研究了 AFB1 誘導后黑曲霉 FS10 的脫除變化。

2.5 AFB1 對黑曲霉 FS10 脫除能力的誘導作用

如圖 6（a）所示，AFB1 刺激誘導 24 h 后的黑曲霉 FS10 對比未做處理的黑曲霉 FS10 發現，菌體誘導組對 AFB1 脫除效果有一定提升，但效果不顯著，可能由于短時間 AFB1 刺激對黑曲霉 FS10 生長有一定抑制作用導致黑曲霉 FS10 菌體數量有限，其吸附能力在此時變小，但誘導組比未誘導組提前適應毒素環境， 大膽猜測可能 AFB1 進入黑曲霉 FS10菌株內并參與了該菌株的代謝促進產出更多有降解能力的物質。而圖 6（b）所示，誘導黑曲霉 FS10 后發酵液對 AFB1 的脫除作用明顯得到提升，36 h 后脫除率提升了 10.01%。從菌株降解能力層面來看， AFB1 的刺激對黑曲霉 FS10 產生了積極的影響。本研究結果充分說明了在 AFB1 刺激下， 黑曲霉 FS10菌株發酵液脫除 AFB1 能力上升，推斷 AFB1 處理可以使黑曲霉產生更多的孢外降解蛋白。

2.6 AFB1 對黑曲霉 FS10 微觀形態的影響

為了進一步研究黑曲霉 FS10 在AFB1 降解過程中的變化， 分別選取了 24、36、48 h 3 個 AFB1 降解速率最快的時間點進行黑曲霉 FS10 微觀結構的分析。如圖 7 所示，可以觀察到 24 h 時，相較于對照組，AFB1 處理組出現了明顯的皺縮，這表明 AFB1 刺激對黑曲霉 FS10 正常生長產生了一定的影響；36 h時，AFB1 處理組相較于對照組雖然仍有明顯皺縮，但與 24 h 時相比這種皺縮現象明顯減弱；而 48 h時相較于對照組而言，處理組并未發現明顯的皺縮現象。出現這種現象的原因可能是：

1）黑曲霉 FS10對毒素環境已經產生了一定的適應能力；

2）毒素被降解，毒素含量有明顯降低從而對其影響減小。

2.7 AFB1 對黑曲霉 FS10 轉錄組學分析

2.7.1 差異基因表達分析 火山圖展示的是基因分布情況及基因的表達倍數差異和顯著性的結果，正常狀況下， 該圖左右差異基因分布應大致對稱。如圖 8 所示， 左側為 AFB1 處理組相比于對照組的下調基因， 右側為 AFB1 處理組相比于對照組的上調基因。對照組和處理組共有差異基因 15 545 個，其中顯著表達的差異基因有 27 個， 顯著上調的基因為 2 個，顯著下調的基因為 25 個。

2.7.2 差異基因功能富集分析 GO 富集分析主要包括細胞組分（cellcular component，CC）、分子功能KEGG 是一個整合了基因組信息、 生化系統功能信息和化學信息的綜合性數據庫[29]。 結合 KEGG數據庫對差異顯著基因參與的相關代謝通路進行富集，由圖 10 可知差異基因共富集到 11 個相關的代謝通路，其主要參與了丙酮酸代謝、硒化合物代謝、色氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、MAPK 信號通路、氧化磷酸化等。

三羧酸循環是生物體內普遍存在的代謝途徑，丙酮酸是進入三羧酸循環的關鍵代謝物[30]，與丙酮酸生成有關基因 PPSA、MAEB 的下調，可能會減少丙酮酸的生成， 從而導致三羧酸循環通量降低，減小能量產生；氧化磷酸化有關基因 COX3 的下調同樣會造成能量生產的減少。這可能是 AFB1 對黑曲霉的生長造成一定的影響，從而導致黑曲霉產生一種自我保護機制。CAT 是細胞防御體系重要的抗氧化酶，能夠催化氧化還原反應清除活性氧，抵御氧化性損傷[31]，AFB1 處理會造成黑曲霉FS10 氧化性損傷的產生，但隨著 AFB1 被降解，氧化損傷得以緩解，從而造成 36 h 時 CAT 的下調，這一推測與圖 7中的微觀形態研究結果相一致。MetE 編碼的蛋氨酸合酶和 MetH 編碼的甲硫氨酸合酶是蛋氨酸合成的關鍵酶， 這兩個基因的上調表明 AFB1 的降解可能與蛋氨酸的合成有一定的關系。研究表明 MetE 和MetH 都能與 Zn2+結合來激活同型半胱氨酸（Hcy），Hcy 是蛋氨酸生物合成的最后一步[32]，先前作者所在課題組在黑曲霉 FS10 降解玉米赤霉烯酮（ZEN）的研究中發現，螯合掉發酵液中金屬離子后降解效果明顯減弱[33]，這為作者的猜想提供了一定的依據。

3結語

通過對黑曲霉 FS10 不同組分脫除 AFB1 作用進行研究，發現黑曲霉 FS10 菌懸液對 AFB1 脫除效果最好，72 h 時 AFB1 殘余率僅剩 1.35%，即脫除率高達 98.65%。黑曲霉 FS10 孢子對 AFB1 無明顯脫除作用，但菌絲體對 AFB1 有一定的吸附作用。黑曲霉 FS10 發酵液中可能存在某種對 AFB1 有降解能力的特異性物質， 因此黑曲霉 FS10 發酵液對 AFB1 有明顯脫除效果。經過 AFB1 提前刺激誘導黑曲霉FS10，其發酵液脫除 AFB1 能力有明顯的提升，36 h后脫除率提升了 10.01%， 推測可能由于 AFB1 進入黑曲霉 FS10 菌株內并參與了該菌株的代謝， 促進其產出更多有降解能力的物質。不同 AFB1 刺激時間下黑曲霉 FS10 的微觀形態表現出隨著 AFB1 刺激時間的延長， 黑曲霉 FS10 菌體表面皺縮會向正常方向好轉， 推測黑曲霉 FS10 已經適應毒素環境或者此時毒素含量有明顯降低從而對其影響減小。轉錄組學分析表明，AFB1 主要引起能量代謝基因和抗氧化酶基因的下調， 這可能是黑曲霉 FS10 受AFB1 刺激后產生的一種自我保護反應。蛋氨酸合成基因的上調表明 AFB1 的降級可能與蛋氨酸的合成有一定的關系，但具體的黑曲霉 FS10 降解 AFB1 的機理還需要進一步探究（此文章轉發自食品與生物技術學報-楊陽）